Die Toxine A und B von Clostridium difficile sind einkettige Proteintoxine, die als Hauptpathogenitätsfaktoren der Antibiotika-assoziierten pseudomembranösen Colitis gelten. Auf zellulärer Ebene inaktivieren sie durch Mono-Glucosylierung die kleinen GTPasen der Rho-Familie. Die inflammatorische Wirkung der Toxine auf die Colonmukosa lässt sich jedoch nicht durch den molekularen Wirkmechanismus erklären. Die Antragsteller konnten zeigen, dass beide Toxine sowohl in der Colonozyten-Zelllinie Caco-2 als auch in der humanen Mastzelllinie HMC-1 zu einer Aktivierung der proinflammatorischen Signalwege (p38 MAPK, NF-κB und JNK) führen mit eindeutiger Präferenz des p38 MAP Kinase-Weges. Die Mastzellen werden direkt durch die Toxine aktiviert, sodass es zu einer Degranulation und Zytokin-Freisetzung kommt. Die Beeinflussung der Genexpression der Zielzelle durch die Toxine wurde mit DNA-Micro-Arrays analysiert und ergab ein erstaunlich eingeschränktes Spektrum an hochregulierten Genen in Colonozyten. Die stärkste Veränderung zeigte mit einer 15-fachen Hochregulation die RhoB-GTPase, die dabei gleichzeitig aktiviert wird. Damit wurde das bisherige Paradigma widerlegt, dass Toxin A ein ausschließlicher Inhibitor von GTPasen ist. Rekombinantes Toxin A steht zur Verfügung, so dass die Wirkung von Toxin A - frei von clostridialen Kontaminationen - erfolgen kann; damit ist ein System etabliert, dass die funktionelle Expression von mutiertem Holo-Toxin A erlaubt. Auf Grundlage dieser Befunde soll das Projekt mit folgenden Fragestellungen weitergeführt werden:

1. Über welche Mechanismen aktivieren die Toxine die stressaktivierten Signalwege (p38 MAPK) und welche funktionelle Bedeutung hat dies für die Zielzelle der Toxine?

2. Die funktionelle Bedeutung des als immediate-early gene product klassifizierten RhoB als Zellantwort auf Toxin A soll geklärt werden, insbesondere unter dem Aspekt der Infektabwehr (eine Beteiligung von RhoB an der Apoptose und der NF-κB-Hemmung sind beschrieben). Es wird vermutet, dass Toxin A auf der Ebene der Colonozyten eher eine entzündungshemmende Zellantwort induziert und insofern die inflammatorische Antwort auf die Toxine moduliert.

3. Im Mausmodell soll die Wirkung von Toxin A auf die in vivo-Relevanz der an Zelllinien erhobenen Befunde überprüft werden. Dazu wird zunächst die Toxinwirkung an primären Colonozyten, isoliert aus dem Mäusecolon, bezüglich Genexpression und Signaltransduktion analysiert. Im zweiten Schritt wird Toxin A vergleichend mit der enzymdefizienten Form im Organkontext getestet; dazu wird durch lokale Toxin A-Applikation eine pseudomembranöse Colitis induziert, und es werden die Befunde bezüglich Histologie, Genexpression (DNA-Micro-Array), Zytokinbildung und Signaltransduktion erhoben. Ziel ist es, zu verstehen, über welche Mechanismen Toxin A ein inflammatorisches Geschehen im Colon induziert und steuert.