Sequenzierung von E. coli Nissle 1917: Funktionelle Genomanalyse in vivo und in vitro und molekulare Analyse probiotischer Effekte

Das beantragte Forschungsprojekt beschäftigt sich mit der molekularen und funktionellen Analyse des probiotischen Effekts von E. coli Nissle 1917 auf der Seite des Mikroorganismus und seines Wirts. Grundlage hierfür ist unter anderem die Sequenzierung und Annotation des gesamten Genoms von E. coli Nissle 1917, die in der Abteilung Genomanalyse der GBF durchgeführt wird. Im Rahmen der ersten Förderperiode konnten mit Hilfe biomathematischer Methoden kodierende Sequenzen in der noch nicht annotierten Rohsequenz von E. coli Nissle 1917 identifiziert, sowie eine Rekonstruktion und Visualisierung seines metabolischen Netzwerks durchgeführt werden. Das metabolische Netzwerk von E. coli Nissle 1917 entspricht weitestgehend demjenigen des sequenzierten uropathogenen E. coli Isolats CFT073. Darüber hinaus konnten 108 Gene identifiziert werden, die für E. coli Nissle 1917 spezifisch sind. Während in der ersten Antragsphase neben der Sequenzierung vor allem der Aufbau von in vitro und in vivo Modellsystemen für die Analyse probiotischer Effekte im Vordergrund stand, sollen in der kommenden Antragsperiode Untersuchungen zur Aufklärung der molekularen Grundlagen für die probiotische Wirkung von E. coli Nissle 1917 durchgeführt werden. Im Rahmen unserer bisherigen Arbeiten in diesem Teilprojekt haben wir mit einem Kokulturmodell in vitro-Surrogatmarker für den probiotischen Effekt von E. coli Nissle 1917 identifizieren können. Basierend auf diesen Vorarbeiten werden wir mit Hilfe von E. coli-Deletionsmutanten nach Genen von E. coli Nissle 1917 suchen, die einen Einfluss auf die Genexpression dieser Surrogatmarker haben, und damit möglicherweise auch auf den probiotischen Effekt des Stamms. Mit Hilfe einer vor kurzem beschriebenen Einschritt-Inaktivierung chromosomaler Gene unter Verwendung von PCR-Produkten sollen dabei zunächst die 108 Gene deletiert werden, die spezifisch für E. coli Nissle 1917 sind. Parallel dazu werden wir mit Hilfe von Genexpressionsarrays und, in Zusammenarbeit mit dem Teilprojekt A09, mit einer Promotor-Reporter-Fusionsbibliothek nach in vivo exprimierten Genen von E. coli Nissle 1917 suchen. Diese sollen funktionell charakterisiert und so auf ihre mögliche Bedeutung für die probiotischen Eigenschaften des Stamms hin untersucht werden. Aufbauend auf unseren Vorarbeiten der vergangenen Förderperiode, im Rahmen derer wir Protokolle zur stabilen Kolonisierung des Darms konventioneller und gnotobiotischer Mäuse mit E. coli Nissle 1917 entwickelt haben, werden wir mit Hilfe von AFFYMETRIX MOE430A Maus-Arrays und Real-time RT-PCR die in vivo-Genexpression intestinaler Epithelzellen der Maus untersuchen. Ziel ist es hierbei, neben der Identifizierung von Kandidatengenen für den probiotischen Effekt im Darmepithel der Maus, auch die in vivo-Bedeutung der in vitro gefundenen Surrogatmarker zu überprüfen. In aktuellen Arbeiten beschäftigen wir uns ferner mit der Verwendung von E. coli Nissle 1917 für die intestinale in situ-Synthese rekombinanter Proteine zur gezielten therapeutischen Immunmodulation im Darm. Wir haben hierfür auf der Basis des E. coli α-Hämolysins ein Plasmid konstruiert, das die Synthese und Expression heterologer Moleküle mit Hilfe des E. coli Hämolysin-Transportsystems erlaubt. Gegenwärtig sind wir dabei, E. coli Nissle 1917-Stämme herzustellen, die murines IL-10 oder IFNγ oder humanes IL-2 exprimieren. In Zusammenarbeit mit dem Projekt A04 soll in der nächsten Förderperiode untersucht werden, welchen Einfluss die Besiedlung mit den rekombinanten E. coli Nissle 1917 Stämmen auf den Verlauf chronischer Darmentzündungen sowie die Induktion mukosaler und/oder peripherer Toleranz hat.